PCR teszt

Korábbi bejegyzésünkben utaltunk rá, hogy a SARS-CoV2 ('új típusú' koronavírus) kimutatására két alapvető technikai irány áll rendelkezésünkre. Ez a molekuláris biológiai (PCR alapú) módszer, illetve a szerológiai (antitest kimutatás) vizsgálatokat jelenti.

Jelen bejegyzés a PCR reakcióval foglalkozik részletesebben.

A PCR - polimeráz lánc -reakció (polymerase chain reaction) lehetővé teszi - többek között - a szervezetben jelenlévő kórokozó genetikai anyagának kimutatását. Ehhez elsődlegesen szükség van a fertőzött területről történő mintavételre van szükség. Jelen esetben ez az orrüreget és a garatot jelenti. A vírus különösen jelentős mennyiségben lehet jelen ezen szervek hámsejtjeiben. A mintavétel során egy mintavevő pálcával törlést végzünk a nevezett szervek felszínén, amelynek során a hámsejtek a mintavevő eszközre kerülnek. A mintavételi pálcát ezt követően egy ún. VTM (vírus transzport médium) oldatba helyezzük. Ilyen formában kerülnek a minták a vizsgáló laboratóriumba.

A PCR vizsgálatok elvégzése speciális molekuláris biológiai részleggel rendelkező mikrobiológiai laboratóriumban történik. Magyarországon elsőként a Nemzeti Népegészségügyi Intézet (NNK) laboratóriuma végezte ezeket a vizsgálatokat, majd több laboratórium is kijelölésre került ezen vizsgálatok elvégzésére. A vizsgálatok elvégzése szigorú biztonsági körülmények között zajlik a speciális (ún. BSL2/3 szintű) biztonsági laboratóriumokban. 

A vírus genetikai anyagát (koronavírus esetén RNS) a beérkezett mintából először "ki kell nyerni", izolálni kell. (A vírus kimutatásának ez az egyik legérzékenyebb és jelentős munkaidőt, energiát igénylő része.) Ezt követően kerül sor a PCR reakció kivitelezésére. A SARS-CoV2 vírus esetében egy valós idejű (real time) reverz transzkripciós PCR folyamat zajlik. Ennek lényege, hogy a vírus RNS-ről (annak bizonyos génjeiről) előbb egy DNS másolatot (cDNS) kell előállítani, kihasználva a nukleinsavak természetben is meghatározó "önreprodukciós" képességét. A továbbiakban ezt a DNS másolatot "felsokszorozni" (amplifikálni) láncreakció szerűen, több ciklusban (akár 40-50). Ennek révén a beteg mintájában - akár igen kis mennyiségben jelenlévő (amennyiben a beteg pozitív) - jelenlévő vírusgén nukleinsav szakasza nagy mennyiségben vizsgálhatóvá válik. 

A SARS-CoV2 vírus különböző fehérjéket tartalmaz (N: nukleokapszid; E: envelope; S: spike; RdRP: RNaseP), melyeket a vírus RNS meghatározott génjei kódolnak. A diagnosztikában - különösen a megerősítő tesztek esetén - a WHO (Egészségügyi Világszervezet - World Health Organization) és a CDC (Egyesült Államok Járványügyi Központja - Centers for Disease Control and Prevention) ajánlásai alapján egy mintából legalább két különböző virális gén kimutatása szükséges, hogy a betegség diagnózisát kimondjuk.

A PCR reakciót a COVID-19 fertőzés diagnosztikájának ún. "gold standardjaként" tartjuk számon. A pozitív eredmény egyértelműen jelzi az adott időben a fertőzés fennállását. Ugyanakkor bizonyos esetekben a vírus jelenléte ellenére - igen kis százalékban ugyan -, de negatív eredményt kaphatunk. (A laboratóriumi tesztek szenzitivitásáról és specificitásáról a későbbiekben részletesen szó lesz majd.)

Mi lehet ennek az oka?

  • A laboratóriumi vizsgálatok már a laboratóriumon kívül elkezdődnek. (preanalitika) Az első lépés a mintavétel, ami alapvetően meghatározza a teszt végső eredményét. Amennyiben nem megfelelő minőségű a mintavétel, kevés hámsejtet sikerül a felszínekről "letörölni", az - a vírus esetleges jelenléte ellenére - tévesen negatív eredményt szolgáltathat. 
  • Amennyiben a levett minták tárolásában valami probléma adódik (maximum 24 óráig 2-8 C-on tárolhatóak a levett minták), szintén álnegatív eredményt kaphatunk. 
  • Ritkán, de előfordulhat olyan technikai probléma (PCR inhibitor, vírus mutáció, stb.), amely szintén tévesen befolyásolja az eredményt. (analitika) 
  • Végül nagyon fontos kérdés a mikrobiális betegségek vizsgálatában az ún. diagnosztikus ablak időtartama. (Ebben az időszakban nyerhető megfelelő eredmény az alkalmazott módszeremmel az adott kórokozó jelenlétéről, vagy hiányáról.) A klinikai tünetek megjelenése előtt több nappal is jelen lehet a vírus a szervezetben. Amennyiben azonban a fertőzés nagyon korai stádiumában kerül sor mintavételre, még olyan alacsony mennyiségben lehet jelen a vírus, hogy PCR módszerrel sem kimutatható. Ugyanez igaz a túl késői stádiumra (a betegség lecsengésének végén), amikor már szintén olyan ki mennyiségű a vrus RNS, hogy a PCR módszer "érzékenységi küszöbe" alá kerül. Ilyenkor jelen van még a kórokozó, de már nem mutatható ki molekuláris biológiai módszerekkel sem. 

Rendkívül fontos ezért, hogy a tesztelések orvosi felügyelet mellett és megfelelő indikációval  történjenek, hiszen a betegség aktivitásának alakulása, a klinikai tünetek függvényében szükséges lehet a vizsgálatok ismételt elvégzése, melynek megítélése nagy körültekintést és széleskörű orvosszakmai kompetenciákat igényel. 

Szerző: Prof. Dr. Fodor Bertalan intézetigazgató egyetemi tanár, ME, EK

Irodalmak, hivatkozások:

Sungnak, W., Huang, N., Bécavin, C. et al. SARS-CoV-2 entry factors are highly expressed in nasal epithelial cells together with innate immune genes. Nat Med (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0868-6

https://www.who.int/publications-detail/laboratory-testing-for-2019-novel-coronavirus-in-suspected-human-cases-20200117

https://www.youtube.com/watch?v=Vd38iS_W7ww

Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM) 2020; 10.1515/cclm-2020-0285

https://www.ecdc.europa.eu/sites/default/files/documents/covid-19-guidance-discharge-and-ending-isolation-first%20update.pdf